Η μάχη της Αλαμάνας διεξήχθη στις 23 Απριλίου το 1821 και έμεινε με την πιο ηρωική γεύση στην ελληνική ιστορία. Ο Διάκος μαζί με τον Πανουργιά και τον Δυοβουνιώτη ανέλαβαν να φυλάξουν τα τρία σημεία όπου υπήρχαν δρόμοι προς την Άμφισσα· ο Δυοβουνιώτης τη γέφυρα του Γοργοποτάμου, ο Πανουργιάς τη Χαλκομάτα και ο Διάκος την Αλαμάνα. Μετά τη σφοδρή επίθεση που δέχτηκαν οι Έλληνες από τα στρατεύματα του Ομέρ Βρυώνη, ο Δυοβουνιώτης και ο Πανουριάς αναγκάστηκαν να υποχωρήσουν, η αντίσταση όμως στην Αλαμάνα συνεχιζόταν, ενώ δεχόταν επίθεση από δυτικά και βόρεια από συντριπτικά υπέρτερες δυνάμεις. Ακόμα κι όταν οι άνδρες του Διάκου του πρότειναν να φύγει, εκείνος αρνήθηκε να εγκαταλείψει τους συντρόφους του με τη φράση: «ο Διάκος δε φεύγει. Δεν αφήνει τους συντρόφους του». Τραυματίστηκε στο δεξί του χέρι και το σπαθί του έσπασε και όπως ήταν περικυκλωμένος έπεσε αιχμάλωτος στα χέρια των αντιπάλων του.
Ο Διάκος μεταφέρθηκε από τους Τούρκους στη Λαμία, όπου τον φυλάκισαν σε ένα εγκαταλελειμμένο σπίτι. Ο Ομέρ Βρυώνης, εκτιμώντας τις αρετές του ως πολεμιστής, του πρότεινε να αλλαξοπιστήσει και να ασπαστεί το Ισλάμ. Η απάντηση του Διάκου είναι γνωστή:
«Εγώ Γραικός γεννήθηκα, Γραικός θε να αποθάνω!»
Έτσι, στις 23 Απριλίου του 1821, ο ήρωας της Αλαμάνας καταδικάστηκε στο μαρτύριο του ανασκολοπισμού: από το κάτω μέρος του μελλοθάνατου περνούσανε μια σούβλα που έβγαινε στην πάνω μεριά, ανάμεσα στους ώμους, χωρίς να πειράξει ζωτικά όργανα. Ύστερα, στήνανε τη σούβλα όρθια, έως ότου πεθάνει με φρικτούς πόνους ο κατάδικος.
Ο Διάκος αντιμετώπισε τον μαρτυρικό του θάνατο με θάρρος. Μόνο ένα παράπονο βγήκε απ’ τα χείλη του, προβλέποντας την ανάσταση του Ελληνισμού:
«Για δες καιρό που διάλεξε ο χάρος να με πάρει,
τώρα που ανθίζουν τα κλαδιά και βγάζει η γης χορτάρι»
Αφού τοποθετήθηκε στη σούβλα, λοιπόν, στρίψανε το κορμί του προς το βασίλεμα ώστε να τον καίει ο ήλιος. Γύρω του, οι Τούρκοι τοποθέτησαν περίπου ογδόντα κεφάλια από Έλληνες συμπολεμιστές του.
Οι δήμιοί του είχαν απαγορεύσει στον οποιοδήποτε να τον πλησιάσει. Η παράδοση λέει, ότι ένας Αρβανίτης, προσπαθώντας να γλυτώσει τον Διάκο από το μαρτύριο, τον πυροβόλησε από το σημείο που βρίσκεται σήμερα η πλατεία Διάκου, χωρίς όμως να καταφέρει να τον σκοτώσει, παρά μόνο να τον τραυματίσει. Όταν η νύχτα έπεσε, ένα φούρναρης, ο Παναγιώτης Ψωμάς, πλησίασε τον Διάκο και του έδωσε νερό. Μόλις ο Διάκος ήπιε λίγες γουλιές, ξεψύχησε.
Έξι μέρες μετά τον θάνατό του, και αφού πλέον η δυσοσμία ήταν ανυπόφορη, οι Τούρκοι πέταξαν το λείψανό του μαζί με τα κομμένα κεφάλια, σε κοντινό χαντάκι. Οι Χριστιανοί, όμως, σύμφωνα με την παράδοση, βγήκαν κρυφά τη νύχτα και έθαψαν το σώμα του.